Protocoles d'analyses du sperme et des interactions spermatozoïdes - glaire cervicale
Identification de leucocytes par coloration des peroxydases
Référence : Kit LeucoGnost-POX, Merck N° 16303
La réaction des peroxydases, principalement la réaction significative cytochimique de la myéloperoxydase, sert à la mise en évidence des éléments cellulaires myéloïques, dans laquelle le degré de maturité des granulocytes arrivant à maturité peut être largement apprécié d’après l’intensité de la réaction colorée brun-noir.
PrincipeLes peroxydases sont des catalases lysosomales qui transfèrent un donateur approprié (autrefois la benzine carcinogène, ici : chloro-4-naphtol-1) sur un peroxyde (ici le superoxyde d’hydrogène). Ce faisant, le donneur chloro-4-naphtol-1 est oxydé et transformé en un colorant insoluble brun-noir qui peut être considéré comme un indicateur de l’activité correspondante des peroxydases.
Réactifs
Dans le test:
- Réactif 1 : chloro-4-naphtol-1.
- Réactif 2 : tris(hydroxyméthyl)-HCl tampon.
- Réactif 3 : solution de superoxyde d’hydrogène.
- Le coffret suffit pour 48 réactions de coloration.
- Article n°12327 Mélange de fixation 1(éthanol/formaldéyde).
- Article n° 9249 Hémalun en solution selon Mayer.
- Article n° 983 Ethanol absolu pour analyses (ne pas utiliser de méthanol).
- Article n° 8562 Aquatex comme agent d’inclusion et H2O distillée.
Utiliser des frottis de sperme séchés à l’air.
| Fixer les frottis dans la solution éthanol/formaldéhyde | 1 min. |
| Rincer sous l’eau courante | 10 sec. |
| Immerger dans la sol. de coloration* | 10 min. |
| Rincer avec de l’eau distillée | 10 sec. |
| Sécher à l’air | |
| Coloration ultérieure avec la sol. d’hémalun de Mayer | 2 min. |
| Rincer à l’eau courante | 3 - 5 min. |
| Sécher à l’air et immerger avec un agent d’inclusion et un couvre objet | |
* Dissoudre le contenu d’un flacon de réactif 1 dans 15ml d’éthanol et l’introduire dans la cuve de coloration. En agitant, ajouter 45ml d’H2O dist., 10 gouttes de réactif 2 et 2 gouttes de réactif 3. La solution réactionnelle est incolore et stable 3 heures.
RemarquesLes frottis doivent être desséchés au moins 30 min. à l’air avant la réaction cytochimique proprement dite et doivent être fixés conformément au mode opératoire respectif.
- Les quantités de substance dans tous les sets de coloration doivent être mesurées de telle manière que toutes les réactions cytochimiques puissent être exécutées sans matériel auxiliaire compliqué dans des cuves habituelle de 60ml.
Comme les solutions de réactif prêtes à l’emploi n’ont souvent qu’une stabilité limitée, avant toute coloration elles doivent être préparées fraîchement.
Dans les cuves de 60 ml. selon Hellendahle avec élargissement (Assistent n° de commande 2460), correspondant à une réaction de coloration, on peut colorer simultanément jusqu'à 8 porte-objects et stocker dos à dos jusqu’à 16 porte-objects.
- Sans inclusion, la coloration est stable environ 3 jours, recouverte avec une huile d’immersion seulement quelques heures.
- Avec un agent d’inclusion et un couvre-objet, la stabilité de la coloration peut être prolongée jusqu’à plusieurs mois.
- Conservation / stabilité du coffret : Conservé selon les prescriptions (+2°C à +8°C), le coffret est stable au moins 24 mois.
Toutes les cellules de la série de maturation des neutrophiles et en particulier des éosinophiles sont nettement positifs (granulés de colorations brun-noir) à la peroxydase.
La majorité des monocytes normaux réagit également de manière positive à la peroxydase ; leur coloration est toutefois plus faible par comparaison aux granulocytes neutrophiles et éosinophiles.
Les granulocytes basophiles ainsi que toutes les cellules de la série lymphatique et érythropoïétique sont négatifs à la peroxydase.