Protocoles d'analyses du sperme et des interactions spermatozoïdes - glaire cervicale

Tests de pénétration in vitro dans la glaire cervicale

Une répartition détaillée de l’interaction sperme - mucus cervical doit être faite en utilisant les tests in-vitro de pénétration muco-cervicale.

Il y a 3 catégories:

• le test sur lame
• le test de contact mucus cervical / sperme
• le test de tube capillaire

Les deux premiers sont faciles à réaliser et donnent les informations utiles (de base). Ils sont décrits plus loin comme tests de routine dans la répartition qualitative du sperme.

Le test du capillaire est plus sophistiqué et donne une indication de mesure semi-quantitative du taux de pénétration du sperme dans le mucus. Un protocole est donné sous l’appendice XXII du manuel de laboratoire WHO, 1992.

Les tests d’interaction in vitro doivent être réalisés dans l’heure qui suit le recueil du sperme.

Remarque : Ces tests sont effectués de façon simplifiée ou direct (mucus épouse + sperme époux) ou avec des contrôles ou tests croisés avec du sperme et du mucus de « donneurs » surtout lorsqu’ils sont : soit positif (SCMC) ou anormaux (test de la lame).

Les tests croisés se réalisent de la façon suivante:

• sperme époux + mucus épouse
• sperme époux + mucus donneur
• sperme donneur + mucus épouse
• sperme donneur + mucus donneur

Note: Lorsque l’on ne dispose pas de mucus cervical de type pré-ovulatoire,on peut utiliser soit des gels de substitution (en remplacement pour des études autres que diagnostiques), soit du mucus cervical bovin qui présente des propriétés similaires au mucus humain de milieu de cycle et les spermatozoïdes le pénètrent bien.

Test sur lame simplifié

Matériel nécessaire

• Sperme
• Mucus cervical
• Lame 76x26mm
• lamelles 22x22mm
• objectifs 40x
• oculaires 10x

Le test simplifié ou direct se pratique avec le sperme de l’époux et le mucus de l’épouse.

Effectuer les analyses habituelles pour le sperme et le mucus.

Manipulations

Une goutte de mucus cervical est déposée sur une lame et recouverte d’une lamelle 22 x 22 mm. Une épaisseur standard de préparation peut-être obtenue en faisant reposer les bords de la lamelle sur de la graisse de silicone contenant des microsphères de verre de 100um de diamètre (p.36, annexe du WHO). Une goutte de sperme est déposée de chaque côté de la lamelle et en contact avec le bord.

Ainsi, le sperme migre par la force capillaire sous la lamelle et une interface visible entre le mucus et le sperme est obtenue.

Cette préparation est incubée une demi-heure à l’étuve à 37°C.

A l’interface et en quelques minutes, des projections en forme de doigts se forment (phalanges de fluide séminal) et pénètrent dans le mucus. La plupart des spermatozoïdes pénètrent dans le canal phalangique avant de pénétrer dans le mucus.

Souvent,un seul spermatozoïde a l’air de conduire une colonne de spermatozoïdes dans le mucus.

Une fois dans le mucus, les spermatozoïdes se séparent et vont au hasard. Certains retournent dans la couche de plasma séminal alors que d’autres migrent profondément dans le mucus, jusqu'à ce qu’ils trouvent une résistance due aux débris cellulaires ou aux leucocytes.

Différents types d’informations peuvent être obtenus et exprimés de la façon suivante (WHO Ed. 1992) :

• Résultat normal : Les spermatozoïdes pénètrent dans le mucus et plus de 90% d’entre eux ont un mouvement progressif pendant longtemps.
• Résultat médiocre : Les spermatozoïdes pénètrent dans le mucus mais ne progressent que sur moins de 500 m m (env. 10x leur longueur) à partir de l’interface.
• Pénétration anormale : Les spermatozoïdes pénètrent dans le mucus mais s’immobilisent rapidement ou présentent un mouvement d’agitation saccadé sur place.

Le test est également considéré comme anormal si aucun spermatozoïde ne pénètre le mucus cervical, les spermatozoïdes s’accumulant alors le long de l’interface, que les phalanges de plasma séminal se soient formées ou pas.

Lorsque le but du test est de comparer la qualité de différents échantillons de mucus, un seul échantillon de sperme (avec comptage et mobilité)est utilisé.

D’autres part, quand l’intérêt est d’évaluer la qualité du sperme(différents échantillons), le même échantillon de mucus cervical est utilisé.

Test de contact sperme - mucus cervical (SCMC test = sperm - cervical mucus contact test)

Matériel nécessaire

• Glaire cervicale pré-ovulaire (endocol)
• Sperme frais (pas plus de 1 heure)
• Lames en verre 76x26mm.
• lames couvre-objets 25x40mm
• oculaires 10x
• objectifs 40x
• chambre humide (boite de Pétri)

Le but de ce test est de détecter la présence d'anticorps anti-sperme dans le mucus cervical et/ou le sperme. Ce test évalue également le degré d’inhibition de la pénétration et de la migration induite par les anticorps.

Manipulations

Placer 10 à 50 m l de mucus cervical pré-ovulaire et une quantité égale de sperme frais sur un côté de la lame: mélanger activement les deux matériaux. Placer une autre goutte de sperme à l'autre extrêmité de la lame; recouvrir chaque goutte d'une lamelle. Conserver la préparation dans une chambre humide et laisser 30 minutes à température ambiante.

Après 30 minutes le % de spermatozoides qui ont un mouvement rapide et vigoureux sur place est déterminé (shaking rapide).

La préparation de sperme non mélangé au mucus sert de contrôle.

Les spermatozoïdes immobiles ou présentant une faible agitation ne sont pas comptés.

Les spermatozoïdes agités qui progressent lentement ou se déplacent de manières intermittentes sont classés avec les spermatozoïdes ayant un mouvement d’agitation saccadée sur place.

Un pourcentage élevé de spermatozoïdes présentant un mouvement de type shaking signifie que la plupart des spermatozoïdes ne peuvent traverser le mucus et sont donc incapables d’atteindre l’ovocyte.

Ceux qui bougent et avancent par à-coup sont considérés comme mobiles.

Interprétation

Lorsque un test SCMC positif est obtenu en utilisant sperme/mucus des partenaires, un test croisé utilisant un sperme et un mucus cervical donneurs doit être réalisé pour identifier les anticorps présents dans le sperme ou dans le mucus.

Bien qu’un fort % de spermatozoïdes « frétillants » est très spécifique de la présence d’anticorps anti-sperme, des réactions faussement positives peuvent se produire. Ces réactions sont dues presque toujours à des facteurs muco-cervicaux.

Test du tube capillaire (test de Kremer)

Origine et but du test

Test inventé par Kremer en 1965 et modifié par lui-même en 1980.

Ce test a pour but de mesurer la capacité des spermatozoïdes à pénétrer une colonne de mucus cervical dans un tube capillaire.

Plusieurs types de capillaires sont utilisés, mais on recommande ceux avec une section rectangulaire

Matériel nécessaire

• Glaire épouse
• Sperme mari *
• Glaire donneuse*.
• Sperme donneur*

*Voir sous organisation du matériel en vue des tests de pénétration in vitro.

Matériel de laboratoire nécessaire

• Chambre de Kremer (sperm penetration meter)
• Capillaires rectangulaires 0.2 et 0.3mm (Vitro Dynamics, Rockaway)
• Tuyau avec embout adaptable au capillaire de 0.3mm.
• Plastine ou mastic.
• Microscope (grossissement x400)

Manipulations

Fixer le capillaire rectangulaire de 0.3mm sur l’embout; aspirer très lentement la glaire endocervicale en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulle. Une fois le capillaire rempli, sceller l’une des extrémités du capillaire avec du mastic, du parafilm etc., ce qui provoquera l’extrusion d’une goutte de mucus.

La partie ouverte du capillaire est placée sur la chambre, enfoncée de 0.5cm dans le réservoir contenant le sperme (0.1ml).Fixer le capillaire (partie fermée) avec du mastic.

Placer la préparation dans une chambre humide (plaque de Pétri) pendant 1h à 37°C.

Interprétation du test

Après 1h, la distance de migration, la densité de pénétration, la réduction de migration et la présence de spermatozoïdes avec une mobilité + (forward) sont lues.

Les capillaires doivent être relus 24 h après, pour la présence de spermatozoïdes ayant migré plus loin.

Distance de migration

= distance du réservoir de sperme ® spermatozoïdes le plus loin dans le capillaire

Densité de pénétration

Elle est déterminée à 1 et 4.5 cm du réservoir de sperme. A chaque point (1 et 4.5cm), le nombre moyen de spermatozoïdes/champ microscopique (HPF 10x10) (5 champs adjacents pour obtenir ce nombre moyen).

La moyenne des estimations est exprimée dans une des classes de pénétration pour la classification du test, la pénétration la plus haute est retenue.

Réduction de migration

Elle exprime la diminution de la pénétration du point 1cm au point 4.5cm.Elle est exprimée en tant que différence des différentes valeurs(rank order number) d’ordre numérique.

Mobilité

Compter la totalité des spermatozoïdes mobiles et immobiles. Le résultat à 4.5cm doit être d’au moins 10% de plus de mobiles que dans le sperme natif.

Exemples

• La densité de pénétration à 1 cm est de 51-100spermatozoïdes (classe 6) et de 6-10 spermatozoïdes (classe 3). La valeur de réduction de migration est de 6-3 = 3.
• Densité de pénétration à 1 cm est de 21-50spermatozoïdes (cl.4) et à 4.5 cm de 51-100 spermatozoïdes(cl.6). La valeur de réduction de migration est = 0, car pas de réduction de densité de pénétration.

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Edité par Aldo Campana,