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Protocoles d'analyses du sperme et des interactions spermatozoïdes - glaire cervicale

Dosage de la carnitine

Principe

La carnitine est une substance sécrétée par les glandes accessoires du tractus génital de l’homme. Elle est stockée sous forme d’acéthyl-carnitine qui est utilisé par les spermatozoïdes comme réserve d’énergie. Elle permet donc l’étude de la fonction épididymaire.

Matériel et méthode

Matériel

  • Centrifugeuse
  • Glace
  • Cuvettes en polystyrène
  • Parafilm
  • Spectrophotomètre

Réactifs

  • HClO4 0,6N gardée au froid (4°C) : (Boehringer 15902)
    • 51,6 ml HClO4 concentré + 948,44 ml eau distillée.
  • K2CO3 0,5M : Merck 4928 34,6g / 500 ml.
  • Tris 1M pH 7,8 : (Boehringer 15326)
    • 12,1g / 65 ml HCl 1N.
    • Compléter à 100 ml avec de l’eau distillée.
    • Contrôler le pH.
    • Cette solution se conserve plusieurs mois à 4°C.
  • DTNB 12,5mM : (Boheringer 15011)
    • 50 mg DTNB / 5ml KHCO3 2N.
    • Régler le pH à 7-8 avec environ 2 gouttes de HCl 1N.
    • Ajuster le volume à 10 ml avec de l’eau distillée.
    • Conserver en aliquots de 200 µl dans des tubes éppendorf à-20°C (se garde plusieurs mois).
  • Acétyl-CoA 15mM : (Boehringer 15093)
    • 50mg Ac-CoA ou 47,16 mg Ac-CoA-3Li / 3,8 ml d’eau distillée.
    • Conserver en aliquots de 200µl à -20°C.
  • EDTA 50mM : (Fluka 03679)
    • 0,46g EDTA-Na2H2 (titriplex 3) / 20 ml d’eau distillée.
    • Régler le pH à environ 8 avec 1 ml de KOH.
    • Ajuster le volume à 25 ml avec de l’eau distillée.
  • Carnitine-Acéthyltransférase : (Boheringer 15093)
    • La solution mère est à 5mg / ml.
    • Faire une dilution 1/5 dans du tampon phosphate 0,5 M pH 7,5 (concentration finale : 1mg / ml).
    • La solution peut se garder 1 mois à 4°C.
  • Tampon phosphate 0,5M pH 7,5 : KH2PO4 (Merck 4873) ; KOH (Merck 5021)
    • 6,8g KH2PO4 / 70 ml eau distillée.
    • Régler le pH à 7,5 avec 20 ml KOH 2N.
    • Ajuster le volume à 100 ml avec de l’eau distillée.
  • Solutions standard de carnitine : L-Carnitine-HCl : (Boheringer 836567)
    • 20mg / 100 ml NaCl 0.9%
    • Prétraiter cette solution avec HClO4 et K2CO3 (déprotéinisation).
    • Dilutions de la solution mère :
      • 20mg/100ml NaCl 0,9%
      • 15mg/100ml : 75µl sol.mère + 25µl NaCl
      • 10mg/100ml : 50µl sol.mère + 50µl NaCl
      • 5mg/100ml : 25µl sol.mère + 75µl NaCl

Ces solutions standards peuvent être gardées à -20°C pendant plusieurs mois.

NB :La carnitine est très sensible aux différences de température. Il faut sortir les standards tôt avant l’analyse.

Méthode

Préparation du plasma séminal

  • Centrifuger l’éjaculat pendant 10 min à la vitesse maximum.
  • Prélever le surnageant.
  • Ce plasma séminal peut être gardé congelé à -20°C.

Déprotéinisation des échantillons

  • Prendre 625µl de HClO4 0,6 N froid (4°C).
  • Ajouter 125µl de surnageant.
  • Mettre dans la glace pendant 10 min.
  • Centrifuger 10 min/Vmax.
  • Prendre 500µl du surnageant et le mettre dans 300µl K2CO3 0,5 M.
  • Mélanger.
  • Laisser 10 min dans la glace.
  • Centrifuger.
  • Prélever 500µl du surnageant.

Dosage des échantillons déprotéinisés

Faire le dosage en suivant le tableau : (Préparer directement dans les microcuvettes immergées à 25°C).

  BLANC STANDARD ANALYSE
H2O distillée 850µl 350µl 350µl
Standard - 500µl -
Plasma séminal - - 500µl
Tris pH 7.8 100µl 100µl 100µl
DTNB 10µl 10µl 10µl
Ac-CoA 10µl 10µl 10µl
EDTA 25µl 25µ 25µl
  • Couvrir les cuvettes avec du parafilm.
  • Mélanger et lire la première extinction (E1) à 405 nm.
  • Ajouter après 30 secondes la carnitine-acéthyl-transférase : 5µl dans le blanc, le standard et l’analyse.
  • Mélanger en recouvrant les cuvettes de parafilm.
  • Après 30 min à 25°C, lire l’extinction (E2) à chaque 30 sec.

Calcul de la concentration de la carnitine

1) E2 - E1 = concentration de la carnitine en mg / 100 ml.

Cette concentration est lue sur la courbe standard de carnitine (5 - 10 - 15 - 20 mg / 100 ml).

2) Concentration de la carnitine en mg / éjaculat.

Exemple : concentration lue sur la courbe standard : 6 mg / 100 ml

volume de l’éjaculat : 3 ml

concentration de la carnitine en mg / éjaculat : 6 mg

3) Concentration de la carnitine en µmol / éjac.

1 mol de carnitine = 161,2 g

1 µmol de carnitine = 0,1612 mg

Exemple :

4) Concentration de carnitine en µmol / ml éjaculat:

volume de l'éjaculat: 3 ml

NB : Ne pas oublier d’inscrire les résultats sur le cahier réservé à la carnitine.

Résultats

  • Courbe standard : Faire un graphique de la Densité Optique (ordonnée), en fonction de la concentration en carnitine (abscisse).
  • Inconnues (sperme) : Lire les concentrations en carnitine sur la courbe standard.

Valeurs normales : 0.8-2.85 µmol / éjaculat.