Protocoles d'analyses du sperme et des interactions spermatozoïdes - glaire cervicale

Dosage du zinc

Principe

Préparation de la solution de travail. (Réactif de PAN)

Sol.1) AMMONIAQUE : (solution tampon pH 10)

• Dissoudre 6g de chlorure d'ammonium (NH4CL Merck 1145) dans 20 ml d'H2O dist., puis rajouter 57 ml d'NH3 25% (Merck 5432).
• Compléter le volume jusqu'à 100 ml avec de l'H2O dist.

Sol.2) SDS : (Sodium dodécylhydrogénophosphate ammonium salt Merck 13760)

• Dissoudre 10 g de (S.D.S) dans de l'H2O dist., puis compléter à 500 ml.
• Rajouter 10 g de fluorure d'ammonium(NH4F Merck 1164) et compléter à 900 ml avec de l'H2O dist.

Sol.3) PAN : (Pyridyl-2-azo-1-naphtol-2 Merck 7531)

• Dissoudre 100 mg de PAN dans 100 ml de méthanol (Merck 6009). Se conserve à 4°C.

Pour obtenir la solution de travail (Réactif de PAN), il faut prendre:

• 100ml de la sol. 1
• 900ml de la sol. 2
• 20ml de la sol. 3

Cette solution doit être gardée dans un flacon bien fermé et à l'abri de la lumière. (Temp. ambiante). Se conserve 6 mois.

Concentrations finales

• Ammoniaque: 820 mmol/l
• Chlorure d'ammonium: 110 mmol/l
• Fluorure d'ammonium: 265 mmol/l
• SDS: 68 mmol/l
• Méthanol: 483 mmol/l
• PAN: 79 mmol/l

Solution stock (Standard):

Diluer une ampoule de solution de zinc concentrée (Merck 9953) dans de l'H2O dist. en complétant le volume jusqu'à 1000 ml.

Concentration finale : 15,3mmol/l

Se conserve 6 mois à 4°c.

Courbe standard

Diluer la solution de Zn (15,3mmol/l) selon le tableau suivant.

Dilutions

ZINC	H2O	CONC. mmol/l
0,5 vol.	0,5 vol.	7,65
0,4 vol.	0,6 vol.	6,10
0,3 vol.	0,7 vol.	4,59
0,2 vol.	0,8 vol.	3,06
0,1 vol.	0,9 vol.	1,53
0,05 vol.	0,95 vol.	0,75

Procédure

Préparer les tubes du test selon le schéma ci-dessous.

	BLANC	STANDARD	PLASMA SEMINAL
Réactif de PAN	3 ml	3 ml	3 ml
Plasma séminal	-	-	20µl
Standard	-	20µl	-

Bien mélanger le tout, puis lire les échantillons à l'aide du photomètre. La coloration reste stable plusieurs heures.

• Longueur d'onde : 560 nm

NB: Ne pas oublier d'inscrire les résultats sur le cahier réservé au Zinc.

Résultats

• Courbe standard: Faire un graphique de la Densité Optique (ordonnées), en fonction de la concentration en Zn (abscisse).
• Inconnues(plasma séminal): Lire les concentrations en Zn sur la courbe standard.

Valeurs normales: 4-14µmol/éjaculat.

A partir du 01.01.97, les analyses de zinc dans le sperme se font dans le plasma séminal.

Nous avons effectué(en parallèle) 113 analyses de zinc dans du sperme natif et dans du plasma séminal. Les différences de concentrations entre les deux ne sont pas significatives. De plus la centrifugation est nécessaire pour les analyses de fructose et de carnitine, ce n’est donc pas une manipulation supplémentaire.